諾博萊德 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)Mitochondrial Membrane Potential Kit(JC-10 Assay)

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒  細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

產(chǎn)品貨號(hào)：CA9198

產(chǎn)品名稱：線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)Mitochondrial Membrane Potential Kit(JC-10 Assay)

英文名稱：Mitochondrial Membrane Potential Kit(JC-10 Assay)

產(chǎn)品規(guī)格：100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-20℃，避光，有效期1年

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderCA9198 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)Mitochondrial Membrane Potential Kit(JC-10 Assay) 是一種以JC-10 為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

JC-10 是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針?？梢詸z測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-10 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-10 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí) JC-10 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過 JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。

JC-10 單體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為515nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529nm；JC-10 聚合物的最大激發(fā)波長(zhǎng)為585nm ，最大發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。實(shí)際觀察時(shí)，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。

本試劑盒提供了CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè) 100個(gè)樣品；對(duì)于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè)200個(gè)樣品。

操作步驟（僅供參考）：

1、JC-10 染色工作液的配制：

六孔板每孔所需JC-10 染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的 JC-10 染色工作液的用量以此類推；對(duì)于細(xì)胞懸液每50～100萬(wàn)細(xì)胞需0.5mLJC-10 染色工作液。取適量JC-10（200×），按照每50μLJC-10（200 ×）加入8mL 超純水的比例稀釋JC-10。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-10。然后再加入2mLJC-10 染色緩沖液（5×），混勻后即為 JC-10染色工作液。

2、陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置：

把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照1∶1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細(xì)胞 20 分鐘。隨后按照下述方法裝載 JC-10，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，通常10μMCCCP處理 20分鐘后線粒體的膜電位會(huì)wan全喪失，JC-10 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-10染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)

間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。

3、對(duì)于懸浮細(xì)胞：

(1) 取10～60萬(wàn)細(xì)胞，重懸于0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

(2) 加入 0.5mLJC-10染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 分鐘。

(3) 在孵育期間，按照每1mLJC-10 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的

JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

(4) 37℃孵育結(jié)束后，600g4℃離心3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

(5) 用JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入 1mLJC-10染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g4 ℃離心3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入 1mLJC-10 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g4℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

(6) 再用適量 JC-10 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析

4、對(duì)于貼壁細(xì)胞：

注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。

(1) 對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

(2) 加入 1mLJC-10 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。

(3) 在孵育期間，按照每 1mLJC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

(4) 37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。

(5) 加入2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

(6) 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對(duì)于純化的線粒體：

(1) 把配制好的 JC-10 染色工作液再用 JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。

(2) 0.9mL 5 倍稀釋的 JC-10 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為10～100μg 純化的線粒體。

(3) 用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描（timescan），激發(fā)波長(zhǎng)為 485nm ，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm 。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為485nm時(shí)，可以在475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)。另外，也可以參考下面步驟6 中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行熒光檢測(cè)。

(4) 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6 。

6、熒光觀測(cè)和結(jié)果分析：

檢測(cè)JC-10 單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm ，發(fā)射光設(shè)置為530nm ；檢測(cè) JC-10 聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm ，發(fā)射光設(shè)置為590nm 。

注意：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè) JC-10 單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察 GFP 或FITC時(shí)的設(shè)置；檢測(cè)JC-10 聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3 時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項(xiàng)：

1. JC-10 （200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2. 必須先把JC-10（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC-10 染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-10 染色緩沖液（1×）再加入JC-10（200×），這樣JC-10 會(huì)很難充分溶解，會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測(cè)。

3. 裝載完JC-10 后用JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使JC-10 染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。

4. JC-10 探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。

5. 請(qǐng)勿把JC-10 染色緩沖液（5×）全部配制成JC-10 染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-10 染色緩沖液（5×）。

6. 如果發(fā)現(xiàn)JC-10 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。

7. CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請(qǐng)注意小心防護(hù)。

8. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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