諾博萊德 內質網膜蛋白提取試劑盒

內質網膜蛋白提取試劑盒 常備現貨

產品貨號：P4998

產品名稱：內質網膜蛋白提取試劑盒

產品規格：50T/100T

產品簡介：

中文名稱：內質網膜蛋白提取試劑盒

規格：100T ; 50T

儲存條件：2-8℃，1 year

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

NobleRyder P4998 內質網膜蛋白提取試劑盒

內質網存在于除哺乳動物成熟的紅細胞外的各種真核細胞中。內質網為由生物膜構成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統，膜片間的隙狀空間稱為池，通常與細胞外隙和細胞漿基質之間不直接相通。這種細胞內的膜性管道系統一方面構成細胞內物質運輸的通路，另方面為細胞內各種各樣的酶反應提供廣闊的反應面積。內質網的功能與蛋白質的合成、糖類和脂類的合成、解毒、同化作用有關，并且還具有運輸蛋白質的功能。內質網膜蛋白提取試劑盒可用于各種動物細胞和實體軟、硬組織樣本的內質網膜蛋白的提取。本試劑盒提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白質電泳、免疫沉淀、ELISA、轉錄活性分析、Gelshift凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白。本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應用兼容。

適用樣本：動物細胞/組織

注：

1. 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。

2. 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

3. 試劑拆封后請盡快使用完！

產品簡介：

內質網存在于除哺乳動物成熟的紅細胞外的各種真核細胞中。內質網為由生物膜構成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統，膜片間的隙狀空間稱為池，通常與細胞外隙和細胞漿基質之間不直接相通。這種細胞內的膜性管道系統一方面構成細胞內物質運輸的通路，另一方面為細胞內各種各樣的酶反應提供廣闊的反應面積。內質網的功能與蛋白質的合成、糖類和脂類的合成、解毒、同化作用有關，并且還具有運輸蛋白質的功能。

本試劑盒可用于各種動物細胞和實體軟、硬組織樣本的內質網蛋白的提取。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質電泳、免疫沉淀、ELISA、轉錄活性分析、Gel shift 凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應用兼容。

本試劑盒提取的蛋白樣本含有高濃度的鹽成分，不可直接用于2D電泳，需要除鹽后再用于 2D電泳。如下游實驗需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請使用其他貨號的蛋白提取試劑盒。也可以將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，用脫鹽柱脫鹽處理。

自備試劑和儀器：

離心機、振蕩器、勻漿器、渦旋混勻器、Dounce勻漿器、移液器、冰箱、冰盒，PBS緩沖液、蛋白定量試劑盒，離心管、吸頭、一次性手套

產品特點：

1、使用方便便，從細胞，組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。

2、提取過程簡單方便，將蛋白提取的時間縮短至 30 分鐘-1 小時。

3、含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

4、紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

5、總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結合釋出的蛋白防止沉淀。

6、蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含 6 種獨立的蛋白酶抑制劑，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

使用方法：

一、使用注意事項：

1. 正式實驗前請選取幾個樣本做預實驗，以優化實驗條件，取得優良實驗效果

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。

3. 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

4. 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

5. 如果試劑盒不能短時間內用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

6. 最好使用Dounce勻漿器勻漿，如果沒有Dounce勻漿器，也可用普通玻璃勻漿器勻漿，但是內質網蛋白回收率會下降。

7. 要求離心力30000g-50000g的離心，最好能達到45000g左右。最小離心力需要保證30000g。若實驗室離心機較小達不到30000g的離心力，或者離心管質量不能承受30000g的離心力，請使用能達到的最大離心力。此時內質網得率會相對較低。

8. 如果需要回收所有光面內質網小泡的蛋白，50000g離心步驟的離心力需要提高到100000g。

9. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。

10. 樣品或試劑被細菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導致錯誤的結果。

二、細胞內質網膜蛋白提取：

1. 提取液制備：

每 200μl 冷的蛋白提取液 C 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每 200μl 冷的蛋白提取液 D 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】:

1)根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

2)加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

3)以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取 1-2×10

7個細胞，在 4℃，500×g 條件下離心 2-3 分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞；

3. 用冷 PBS 洗滌兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4. 加入 500μl 冷的試劑 A，置冰上 10 分鐘。

5. 用 Dounce 勻漿器勻漿充分勻漿，然后在 4℃，1000×g 條件下離心 5 分鐘。

6. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管。

7. 在 4℃，11000×g 條件下離心 10 分鐘，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。

8. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

9. 在沉淀中加入 400μl 冷的試劑 B，混勻。

10. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

11. 棄上清，沉淀中加入 100-200μl 冷的蛋白提取液 C，混勻。

【注】:

1)提取液 C 使用前必須保持在 2-8℃條件。

12.在 4℃條件下振蕩 30-40 分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。

【注】:

1)此步驟必須在 2-8℃處理。

2)用振蕩器/搖床的較低轉速，保持液體晃動即可。

3)沒有 2-8℃振蕩條件也可以不振蕩，置 2-8℃靜置，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

13. 在 4℃，12000×g 條件下離心 5 分鐘。棄沉淀，收集上清。

14. 將上清吸入另一干凈離心管，在 37℃水浴 10 分鐘。

15. 在 37℃，1000g 力離心 5 分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為 20-30μl。

【注】:

1)此步驟必須在 37℃條件下離心。

2)沒有 37℃離心條件也可以不離心，稍微延長 37℃水浴時間，至液體澄清，分層清晰。

16. 小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。

【注】:

1)上層部分為內質網內非膜蛋白的蛋白。

2)待下游目的膜蛋白實驗完成后在丟棄此部分。膜蛋白萃取不wan全時此部分蛋白仍可以進行再次提取膜蛋白。

17. 用 50-100μl 冷的試劑 D 膜蛋白溶解液溶解下層內質網膜蛋白部分，即得內質網膜蛋白。

18. 將內質網膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。

【注】:

1)建議用 BCA 法進行蛋白定量。

2)蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

三、組織內質網膜蛋白提取：

1. 提取液制備：

每 200μl 冷的蛋白提取液 C 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每 200μl 冷的蛋白提取液 D 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】:

1)根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

2)加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

3)以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取 50-100mg 新鮮動物組織樣本，用 PBS 洗滌干凈；

3. 用剪刀盡可能剪碎，用冷 PBS 洗滌兩次。

4. 加入 500μl 冷的試劑 A，置冰上 10 分鐘。

5. 用 Dounce 勻漿器充分勻漿 30-40 下，至無明顯固體團塊。然后在 4℃，1000×g 條件下離心 5 分鐘。

6. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管。

7. 在 4℃，11000×g 條件下離心 10 分鐘，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。

8. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

9. 在沉淀中加入 400μl 冷的試劑 B，混勻。

10. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

11. 棄上清，沉淀中加入 100-200μl 冷的蛋白提取液 C，混勻。

【注】:

1)提取液 C 使用前必須保持在 2-8℃條件。

12. 在 4℃條件下振蕩 30-40 分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。

【注】

1)此步驟必須在 2-8℃處理。

2)用振蕩器/搖床的較低轉速，保持液體晃動即可。

3)沒有 2-8℃振蕩條件也可以不振蕩，置 2-8℃靜置，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

13. 在 4℃，12000×g 條件下離心 5 分鐘。棄沉淀，收集上清。

14. 將上清吸入另一干凈離心管，在 37℃水浴 10 分鐘。

15. 在 37℃，1000g 力離心 5 分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為 20-30μl。

【注】:

1)此步驟必須在 37℃條件下離心。

2)沒有 37℃離心條件也可以不離心，稍微延長 37℃水浴時間，至液體澄清，分層清晰。

16. 小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。

【注】:

1)上層部分為內質網內非膜蛋白的蛋白。

2)待下游目的膜蛋白實驗完成后在丟棄此部分。膜蛋白萃取不wan全時此部分蛋白仍可以進行再次提取膜蛋白。

17. 用 50-100μl 冷的試劑 D 膜蛋白溶解液溶解下層內質網膜蛋白部分，即得內質網膜蛋白。

18. 將內質網膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。

【注】:

1)建議用 BCA法進行蛋白定量。

2)蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

注意事項：

1. 本試劑盒僅供科學研究使用，不可用于診斷或治療。

2. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

3. 實驗后完成后所有樣品及接觸過的器皿應按照規定程序處理。

4. 避免皮膚或粘膜與試劑接觸。

5. 如果試劑不小心接觸皮膚或眼睛，應立即用水沖洗。

內質網膜蛋白提取試劑盒 常備現貨

產品訂購信息：

P4998  內質網膜蛋白提取試劑盒  50T/100T