諾博萊德 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（低速離心法）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（低速離心法）  蛋白提取

產(chǎn)品貨號(hào)：P5110

產(chǎn)品名稱：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（低速離心法）

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

中文名稱：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（低速離心法）

規(guī)格：100T ; 50T

儲(chǔ)存條件：2-8℃，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder P5110 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（低速離心法）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于除哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞外的各種真核細(xì)胞中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為由生物膜構(gòu)成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統(tǒng)，膜片間的隙狀空間稱為池，通常與細(xì)胞外隙和細(xì)胞漿基質(zhì)之間不直接相通。這種細(xì)胞內(nèi)的膜性管道系統(tǒng)一方面構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐?，另一方面為?xì)胞內(nèi)各種各樣的酶反應(yīng)提供廣闊的反應(yīng)面積。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能與蛋白質(zhì)的合成、糖類和脂類的合成、解毒、同化作用有關(guān)，并且還具有運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的功能。

傳統(tǒng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取方法需要采用較高的離心力或者采用密度梯度離心，對(duì)實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)設(shè)備要求較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作細(xì)致程度要求較高。如果實(shí)驗(yàn)室沒有能達(dá)到 50000×g 以上的離心力的設(shè)備，則沒法進(jìn)行提取。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（低速離心法）只需要達(dá)到 20000×g 以內(nèi)的離心力即可提取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，一般的常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)均可以滿足使用要求。

本試劑盒可用于各種動(dòng)物細(xì)胞和實(shí)體軟、硬組織樣本的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的提取。

適用樣本：動(dòng)物細(xì)胞/組織

注：

1. 有效期為試劑盒未拆封前按要求條件保存的有效期。

2. 試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！

自備試劑和儀器：

離心機(jī)、振蕩器、勻漿機(jī)/勻漿器、渦旋混勻器、移液器、冰箱、冰盒，PBS 緩沖液、離心管、吸頭、一次性手套

使用方法：

一、使用注意事項(xiàng)：

1. 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

2. 實(shí)驗(yàn)過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過程須保持樣品處于低溫。

3. 最好使用 Dounce 勻漿器勻漿，如果沒有 Dounce 勻漿器，也可用普通玻璃勻漿器勻漿，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白回收率會(huì)下降。

二、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提?。?/span>

1. 取 1-2×10⁷ 個(gè)細(xì)胞，在 4℃，500×g 條件下離心 2-3 分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸

干，收集細(xì)胞；

2. 用冷 PBS 洗滌兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

3. 加入 500μl 冷的試劑 A，置冰上 10 分鐘。

4. 用 Dounce 勻漿器勻漿充分勻漿，然后在 4℃，1000×g 力條件下離心 5 分鐘。

【注】：

1) 先用 Dounce 勻漿器的松型槌初步勻漿 10-20 次，再用緊型槌勻漿 20-30 次。

2) 每上下一個(gè)來回為一次。

5. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。棄沉淀。

6. 將上清在 4℃，11000×g 力條件下離心 10 分鐘。

7. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。棄沉淀。

8. 將上清在 4℃，12000-16000×g 力條件下離心 10 分鐘。棄沉淀，留上清。

9. 在上清中加入 125ul 試劑 B，充分混勻。

【注】：

1) 試劑 B 使用前請(qǐng)充分混勻。

10. 置 2-8℃冰箱靜置過夜。

【注】：

1) 靜置保存時(shí)間不少于 10 小時(shí)。

11. 在 4℃條件下，10000×g 離心 20-45 分鐘。

12. 小心移除上清，收集沉淀。

【注】：

1) 盡可能吸干上清。

2) 吸取時(shí)小心，防止吸掉沉淀。

13. 沉淀即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

三、組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取：

1. 取 50-100mg 新鮮動(dòng)物組織樣本，用 PBS 洗滌干凈。

2. 用剪刀盡可能剪碎，用冷 PBS 洗滌兩次。

3. 加入 500μl 冷的試劑 A，置冰上 10 分鐘。

4. 用 Dounce 勻漿器充分勻漿 30-40 下，至無明顯固體團(tuán)塊。然后在 4℃，1000×g 力條件下離心 5 分鐘。

【注】：

1) 先用 Dounce 勻漿器的松型槌初步勻漿 10-20 次，再用緊型槌勻漿 20-30 次。

2) 每上下一個(gè)來回為一次。

5. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。棄沉淀。

6. 在 4℃，11000×g 力條件下離心 10 分鐘。

7. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。棄沉淀。

8. 將上清在 4℃，12000-16000×g 力條件下離心 10 分鐘。棄沉淀，留上清。

9. 在上清中加入 125ul 試劑 B，充分混勻。

【注】：

1) 試劑 B 使用前請(qǐng)充分混勻。

10. 置 2-8℃冰箱靜置過夜。

【注】：

1) 靜置保存時(shí)間不少于 10 小時(shí)。

11. 在 4℃條件下，10000×g 離心 20-45 分鐘。

12. 小心移除上清，收集沉淀。

【注】：

1) 盡可能吸干上清。

2) 吸取時(shí)小心，防止吸掉沉淀。

13. 沉淀即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

注意事項(xiàng)：

1. 正式實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)選取幾個(gè)樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，取得優(yōu)良實(shí)驗(yàn)效果。

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時(shí)試劑損失。

3. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會(huì)影響使用效果。

4. 樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

5. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

6. 實(shí)驗(yàn)后完成后所有樣品及接觸過的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。

7. 低速離心法分離出的細(xì)胞器純度一般在 50-65%,具體數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)際操作情況會(huì)有所不同, 不適用于進(jìn)行蛋白定位的研究及驗(yàn)證。

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