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亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說明書
微量法 100T/48S
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的mei，廣泛存在于微生物及植物體內，是自然界氮循環過程中的關鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或NH3，從而減少環境中亞硝態氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的 NO —減少，即540nm 處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。
產品名稱 | BG6022-100T/48S | Storage |
提取液：液體 | 112ml | 4℃ |
試劑一：液體 | 4ml | 4℃ |
試劑二：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑三：液體 | 5ml | 4℃ |
試劑四：液體 | 10ml | 4℃避光 |
試劑五：液體 | 10ml | 4℃避光 |
說明書 | 一份 | |
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5ml 蒸餾水溶解。
試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。（如出現沉淀可以 70-80℃加熱溶解）
試劑四：液體 10ml×1 瓶，4℃避光保存。（如出現沉淀可以 70-80℃加熱溶解）工作液：臨用前根據用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
天平、研缽、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、水浴鍋、低溫離心機。
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g， 4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。
空白管 | 對照管 | 測定管 | |
樣本（μl） | 20 | 20 | |
蒸餾水（μl） | 20 | 40 | |
試劑一（μl） | 40 | 40 | |
試劑二（μl） | 40 | 40 | 40 |
混勻后，25℃反應 1h | |||
試劑三（μl） | 40 | 40 | 40 |
充分震蕩 30S | |||
上清液（μl） | 70 | 70 | 70 |
工作液（μl） | 140 | 140 | 140 |
充分混勻，，靜置 3min 后測定各管 540nm 處吸光值，分別記為A 空 白管、A 對照管、A 測定管。空白管只要做一管，每個測定管需設一個對照管。 | |||
計算公式：
標準曲線：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x 為標準品濃度（μmol/ml），y 為吸光值（A 標準管-A 空白管）。
1. 按照蛋白含量計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標÷（V 樣×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T = 1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷W
3. 按照細胞數量計算
酶活單位定義：每 104 個細胞每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標÷（細胞數量×V 樣÷V 樣總）÷T = 1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷細胞數量
V 標：標準液體積，0.04ml；V 樣：體系中加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質量，g
標準曲線：y = 0.6797x + 0.0072，R2 = 0.9997；x 為標準品濃度（μmol/ml），y 為吸光值（A 標準管-A 空白管）。
1. 按照蛋白含量計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷0.6797×V 標÷（V 樣×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷0.6797×V 標÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T = 2.94×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷W
3. 按照細胞數量計算
酶活單位定義：每 104 個細胞每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷0.6797×V 標÷（細胞數量×V 樣÷V 樣總）÷T = 2.94×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷ 細胞數量
V 標：標準液體積，0.04ml；V 樣：體系中加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質量，g
1. 配制好的工作液 3 天內使用完。
2. 若吸光值超過 1.5，將上清液進行適當的稀釋后再加入工作液顯色，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
3. 嚴格控制顯色時間，否則會對結果有影響。
4. 標準曲線線性范圍為 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。
5. A 空白管-（A 測定管-A 對照管）線性范圍為 0.02-1.5。
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