諾博萊德 FlashPure Bacteria miRNA Mini Kit

細菌 microRNA 快速提取試劑盒（免氯仿）

細菌microRNA快速提取試劑盒（免lv仿）

目錄號：91613

產品內容

自備試劑

無水乙醇

保存條件

溶菌mei，常溫運輸， 4℃保存；其他組分，室溫（15 ~ 25℃）保存。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

產品簡介

市場上常見的離心柱型的 RNA Kit/總 RNA Kit，不能有效吸附回收miRNA；Trizol 沉淀抽提法也不能有效沉淀回收全部 miRNA（生物通上有專題文章闡述）。

FlashPure Bacteria miRNA Mini Kit 是專用于提取各種植物組織的miRNA（包含 miRNA 的總 RNA），是通用型 microRNA 快速提取試劑盒（Cat#91015）的升級版，提取過程不再需要使用lv仿，并采用du有的 gDNA 過濾器，高效濾除基因組，得到包含 miRNA 的總 RNA，可直接用于 miRNA和 mRNA 的 RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、芯片、測序等。

注意事項

1. 樣品應避免反復凍融，否則會影響 RNA 的提取得率和質量。

2. 樣品加入裂解液 BRL Plus 勻漿后，樣品可在–80℃保存一個月以上。

重要提示：

① 第一次使用前, 請先在 Wash Solution 1、Wash Solution 2/3 中加入zhi定量無水乙醇，詳見瓶身的標簽。

② 每次操作前，請先配制添加了溶菌mei或者 Lysostaphin 的 TE (PH 8.0)，終濃度為 1mg/ml。

③ 所有離心步驟均需要在室溫（15~37℃）下進行，提取效果更佳！

操作步驟（可得到包含 miRNA 的總 RNA）

1. 離心收集 1 ~ 2 ml 菌液（108 ~ 109細胞）到一個 1.5 ml 離心管, 盡可能che底吸棄上清。

2. 根據細胞的種類和數量，充分重懸細胞在 100 μl（5x108細胞）/ 200 μl（5x108 ~7.5x108 細胞）TE 中（確保已添加溶菌mei或者 Lysostaphin 至TE 中，濃度為 1mg/ml )，或者直接用 TE 重懸后，用干凈槍頭挑取少許溶菌mei加入。

3. 室溫(15~25℃)溫育5min/溶菌mei, 或者37℃溫育15min / Lysostaphin，破解細胞壁。每 2 min 渦旋振蕩 10 sec，幫助破壁。

注意：各種細菌破壁的難易程度不一樣，一般革蘭氏陰性菌 E.coli 使用上面的條件就足夠了，,甚至可能省略該步驟，但是某些革蘭氏陽性菌如B. subtilis 難破壁需要提高溶菌mei濃度到 15mg/ml 和溫育時間到10min。如果金黃色葡萄球jun需要加入 lysostaphin 到 1mg/ml，37℃溫育 15min。總之不同細菌類型破壁難易程度不同，有的難破壁的種類

需要根據用戶自己的具體情況調節mei的種類、工作濃度和溫育溫度、時間，此外還可以聯合使用玻璃珠擊打，機械破壁，蛋白mei K 消化等方法幫助破壁。

4. 短暫離心收集細菌，che底吸棄上清后，加入 500 μl 裂解液 BRL Plus，渦旋震蕩或者吹打混勻，裂解細菌。

5. 物將裂解勻漿液全部加到 gDNA 過濾器中（過濾器放入收集管中），13,000 rpm 離心 1 min，保留濾液，（RNA/microRNA 在濾液中）。

6. 用移液器較精確估計濾液體積（一般 480 μl），向濾液中加入 1.25 倍體積(一般 600μl )的無水乙醇，吹打混勻。

7. 每次轉移≤750 μl濾液混合物至RNA吸附柱中，13,000 rpm離心1min，此時，RNA 被吸附在膜上，棄濾液。重復此過程，直到溶液全部上柱。

8. 加入 700 μl Wash Solution 1（檢查是否已加入乙醇），室溫放置 1 min,13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

9. 加入 500 μl Wash Solution 2/3（檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心 30 sec，棄濾液。

10. 重復步驟 7。

11. 將 RNA 吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm 離心 2 min，除去膜上殘留的留乙醇。

12. 取出 RNA 吸附柱，放入一個 RNase-free 1.5 ml 離心管中，向吸附膜的中央懸空滴加 30-50 μl 的 RNase-free H2O，室溫放置 1 min，13,000 rpm 離心 1 min，管底即包含 miRNA 的總 RNA。

附錄：

microRNA 富集方法（僅僅提取 microRNA，不包含>200 nt 其它總 RNA成份。一般不推薦）

注意：當非特異擴增較多或者擴增背景較高時，可以嘗試使用富集方法提取的 microRNA。

1. 按照前面步驟 1、2 操作，直到得到上清。

2. 轉移上清（約 500 μl）至一個新的離心管中，加入 0.5 倍體積的無水乙醇（必須是室溫的），吹打混勻。

3. 將混合液加入 gDNA 過濾器中，13,000 rpm 離心 1 min，收集濾液 （microRNA 在濾液中）。

此時，RNA吸附柱的膜上是去除了microRNA的總RNA（mRNA、tRNA、rRNA），如果有需要，可以按照前面標準操作步驟 6－10 操作，經漂洗、洗脫后，得到去除了 microRNA 的總 RNA。

4. 較精確估計濾液體積，加入等體積的無水乙醇（必須是室溫的），吹打混勻，不要離心。

5. 每次轉移≤750 μl濾液混合物至RNA吸附柱中，13,000 rpm離心1 min，micoRNA 被吸附在膜上，倒棄濾液。重復此過程，直到所有濾液混合物都上柱。

6. 按照前面標準操作步驟 6－10，經漂洗、洗脫后，得到 microRNA。

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