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Script IV M-MuLV Reverse Transcriptase
IV M-MuLVReverseTranscriptase反轉錄試劑
目錄號：71413
產品內容
Components | 71413-10000 | 71413-50000 |
IV M-MuLV (200U/ μl) | 10000 U | 50000 U |
5x RT Buffer | 250 μl | 5x 500 μl |
保存條件：-20℃保存，有效期 12 個月。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
產品簡介
本制品使用通過基因重組技術克隆表達的點突變型RNase H活性缺失的M-MuLV反轉錄酶Script Hˉ Rtase， 同時經過多點突變，獲得的能高達60℃的第四代反轉錄酶（Script IV M-MuLV），在50-60℃均有較好的反轉錄效果，同時大大的提高了GC含量高，二級結構豐富的RNA模板的反轉錄效率。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA，因此在cDNA第一條鏈的合成反應中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA。Script IV M-MuLV (RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，與MMuLV 相比，具有更強的延伸能力和穩定性，可用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構建等。
適用范圍
第一鏈cDNA合成。可用于低拷貝基因的檢測。
產品特點
合成cDNA片段長度最高可達15 kb。
引物的選擇：
1. 如果RNA模板來源于真核生物，shou選Oligo (dT)，與真核生物mRNA的3’PolyA尾配對，可獲得最高產量的全長cDNA。
2. 如果對一些物種，不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下，shou選Oligo(dT)，不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物。
3. 基因特異性引物(GSP)的特異性最高。但有些情況下，用于PCR反應的GSP無法有效引導第一鏈cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Randomprimer重新進行逆轉錄。
4. Random primer特異性最di，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作為Random primer的模板。當目標區域具有復雜二級結構或GC含量較高，或者模板為原核生物來源，使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導cDNA合成時，可使用Random primer為引物。
5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可將Oligo (dT)與Random primer混合使用（各加1μl /20μl反應體系），可使mRNA的各個區域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR結果的真實性和重復性。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應體系為例)
1．反應體系的配制
操作前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心收集至管底，置冰上備用。
使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：
Components | Volume |
Total RNA | 50 ng - 5 μg |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or | 1 μl |
1 μl | |
1 μl | |
5x RT Buffer | 4 μl |
RNase Inhibitor (40 units/μl) | 0.5 μl |
IV M-MuLV (200U/μl) | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻，點甩離心，置 PCR 儀進行逆轉錄反應。
如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP)，產物用于PCR：50℃孵育30 min；
產物用于qPCR：50℃孵育15 min。
如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后，產物用于 PCR，50℃孵育30 min；
25℃孵育 10 min 后，產物用于 qPCR，50℃孵育 15 min。
注意：如果模板具有復雜二級結構或高 GC 區域，可以先只加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O，混勻，65℃變性 5 min，冰上冷卻，點甩離心后加入其它成分，并將 50℃孵育溫度提升至 55°C，有助于提高產量。
3． 85°C加熱 5 sec，失活RTase和dsDNase，終止反應。
逆轉錄產物可立即用于PCR或qPCR反應，或保存于-20°C，并在半年內使用；長期存放建議分裝后在-70°C保存，cDNA應避免反復凍融。
PCR
建議取2 - 4 μl的cDNA產物原液作為PCR模板。
1. 常規擴增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)
71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)
2. 高保真擴增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)
71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)
qPCR
建議取1~2μl cDNA產物原液作為20μl qPCR反應體系的模板。如果基因表
達量較高，請根據實際情況適當稀釋cDNA模板后使用。
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