FlashPure Tissue/Cell miRNA Mini Kit

動(dòng)物組織/細(xì)胞 microRNA 快速提取試劑盒（免lv仿）

動(dòng)物組織/細(xì)胞microRNA快速提取試劑盒

目錄號(hào)：91409

產(chǎn)品內(nèi)容

自備試劑

無水乙chun

保存條件

室溫（15 ~ 25℃）

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

FlashPure Tissue/Cell miRNA Mini Kit（免lv仿）是通用型 microRNA快速提取試劑盒（Cat#R015）的升級(jí)版，專用于提取各種動(dòng)物組織、細(xì)胞的miRNA（包含 miRNA 的總 RNA），提取過程不再需要使用lv仿，并采用du有的 gDNA 過濾器，高效濾除基因組，得到包含 miRNA 的總 RNA，可直接用于 miRNA 和 mRNA 的 RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、芯片、測(cè)序等。

但是，市場(chǎng)上常見的離心柱型的 RNA Kit/總 RNA Kit，不能有效吸附回收 miRNA；Trizol 沉淀抽提法也不能有效沉淀回收全部 miRNA（生物通上有專題文章闡述）。

注意事項(xiàng)

1. 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)影響 RNA 的提取得率和質(zhì)量。

2. 樣品加入裂解液 MRL Plus 勻漿后，樣品可在–80℃保存一個(gè)月以上。

3. RNA 在裂解液 MRL Plus 中時(shí)不會(huì)被 RNase 降解，但后續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含 RNase 的吸頭和器皿。

4. 取RNA樣本時(shí)，把新鮮組織樣本浸入 RNAsafe (RNA 樣品保存液，91115-100)中，可在 37℃保存一天，在 25℃保存一周，在 4℃保存一個(gè)月，在-20℃或者–80℃長(zhǎng)期保存。

重要提示：

① shou次使用前, 先在 Wash Solution 1、Wash Solution 2/3、70%乙chun

中加入zhi定量無水乙chun，詳見瓶上的標(biāo)簽。

② 所有離心步驟均需要在室溫（15~37℃）下進(jìn)行，提取效果更佳！

操作步驟

1. 動(dòng)物組織：

a．電動(dòng)勻漿：取新鮮組織 10~20 mg 加入 500 μl 裂解液 MRL Plus，電動(dòng)勻漿，直到無明顯組織塊即可。

b．液氮研磨：液氮研磨組織成細(xì)粉，取 10~20 mg 組織細(xì)粉加入500μl 裂解液 MRL Plus，劇烈渦旋振蕩，直到無明顯粉末團(tuán)即可。

c． 將裂解物 13,000 rpm 離心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。下接操作步驟 3。

2. 細(xì)胞

a. 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，加 500 μl 裂解液 MRL Plus（<8x10⁶ 細(xì)胞）, 吹打混勻，劇烈渦旋振蕩20秒，充分裂解。

b. 貼壁細(xì)胞：不需要消化，吸棄培養(yǎng)基后，直接在培養(yǎng)皿中加裂解液MRL Plus（每<8x106細(xì)胞加500μl 裂解液 MRL Plus）進(jìn)行消化、裂解； 或者，先用胰mei消化后離心收集細(xì)胞，然后加入裂解液 MRL Plus，吹打混勻，劇烈渦旋振蕩 20 秒，充分裂解。

c. 下接操作步驟 3。

3. 將裂解勻漿物（或離心得到的上清）全部加入 gDNA 過濾器中（過濾器放入收集管中），13,000 rpm 離心 1 min，保留濾液（RNA 在濾液中）。

4. 向?yàn)V液中加入 1.25 倍體積的無水乙chun，用移液器吹打混勻。

5. 每次轉(zhuǎn)移≤750 μl濾液混合物至RNA吸附柱中，13,000 rpm離心1min，此時(shí)，RNA 被吸附在膜上，棄濾液。重復(fù)此過程，直到溶液全部上柱。

6. 加入 700 μl Wash Solution 1（檢查是否已加入乙chun），室溫放置 1 min, 13,000 rpm 離心30sec，棄濾液。

7. 加入 500 μl Wash Solution 2/3（檢查是否已加入乙chun），13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

8. 重復(fù)步驟 7。

9. 將 RNA 吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm 離心 2 min，除去膜上殘留的留乙chun。

10. 取出 RNA 吸附柱，放入一個(gè)新的 RNase-free 1.5 ml 離心管中，向 RNA吸附膜的中央懸空滴加 30-50 μl RNase-free H2O， 室溫放置 1 min，13,000 rpm 離心 1 min，管底即包含 miRNA 的總 RNA。

11. 得到 RNA/miRNA，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，或于-70℃保存，以免降解。

相關(guān)產(chǎn)品：

71418-25 Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit（加尾法）

71419-500 Script III miRNA Real-Time PCR Assay kit（for qPCR，加尾法）

71613-500 Script III miRNA RT-qPCR Detection kit（71418-25 + 71419-500）

附錄：

microRNA 富集方法（僅僅提取 microRNA，不包含>200 nt 其它總 RNA

成份。一般不推薦）

注意：當(dāng)非特異擴(kuò)增較多或者擴(kuò)增背景較高時(shí)，可以嘗試使用富集方法提取的 microRNA。

1. 按照前面步驟 1、2 操作，直到得到上清或者裂解物。

2. 向上清或者裂解物中加入 0.5 倍體積的無水乙chun（必須是室溫的），吹打混勻。

3. 將全部混合液加入一個(gè) gDNA 過濾器中， 13,000 rpm 離心 1 min，收集濾液（microRNA 在濾液中）。

此時(shí)，RNA 吸附柱的膜上是去除了 microRNA 的總 RNA（mRNA、tRNA、rRNA），如果有需要，可以按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟 6－10 操作，經(jīng)漂洗、洗脫后，得到去除了 microRNA 的總 RNA。

4. 較精確估計(jì)濾液體積，加入等體積的無水乙chun（必須是室溫的），吹打混勻，不要離心。

5. 每次轉(zhuǎn)移≤750 μl濾液混合物至RNA吸附柱中，13,000 rpm離心1 min，micoRNA 被吸附在膜上，倒棄濾液。重復(fù)此過程，直到所有濾液混合物都上柱。

6. 按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟 6－10，經(jīng)漂洗，洗脫后，得到 microRNA。

動(dòng)物組織/細(xì)胞microRNA快速提取試劑盒